Ha valaha is töltött időt digitális patológiás tárgylemezek elemzésével vagy kutatási minták képalkotásával, valószínűleg elgondolkodott azon, hogy egy mikroszkópos tárgylemez-szkenner hogyan rögzít minden részletet ilyen pontossággal – még akkor is, ha a tárgylemezen olyan finom magassági eltérések vagy apró tökéletlenségek találhatók, amelyek egy szabványos fényképezőgép fókuszát kidobják. Nagy teljesítményű digitális diaszkennerek szállítójaként mindig megkapom ezt a kérdést, és ez az egyik legkritikusabb része annak, hogy berendezéseink miért adnak megbízható, konzisztens eredményeket nap mint nap. Nézzük meg pontosan, hogyan működik az élességállítási mechanizmus, miért fontos a különböző felhasználási esetekben, és hogyan tervezték szkennereinket úgy, hogy kiválóak legyenek ezen a területen.
Először is kezdjük az alapokkal: a mikroszkóp tárgylemezei nem teljesen laposak. A szabványos üveglemez körülbelül 1 mm vastag, de biológiai mintákat (például szövetmetszetek, sejtkultúrák vagy citológiai készítmények) helyeznek rá, és magasságuk 10-50 mikronnal változhat – néha többet is, attól függően, hogyan készült a minta. Még a csúszdán lévő kisebb por vagy törmelék is apró, váratlan rétegeket ad hozzá. Ahhoz, hogy a szkenner éles képet készítsen, a fókuszának folyamatosan be kell állítania, ahogy mozog a dián, és ezt gyorsabban kell megtennie, mint ahogyan az emberi szem pislogni tud, miközben a pontosság a mikron töredékén belül marad. Ez nem kis teljesítmény.
A legtöbb mikroszkóp tárgylapolvasó két alapvető fókuszálási technológia egyikét használja: passzív autofókusz (AF) vagy aktív AF, és sok csúcskategóriás modell mindkettőt kombinálja, hogy mindkét világból a legjobbat hozza ki. Kezdjük a passzív AF-el, mert ezt építettük be belépő szintű világosmezős szkennereinkbe, mint például a Brightfield Slide Scanner EScan-1200. A passzív AF nem bocsát ki külső jelet; ehelyett elemzi a tárgylemezről visszaverődő fényt, hogy meghatározza, hol van a legélesebb fókusz. A rendszer szoftvere megvizsgálja a kép kontrasztját kis ablakokon keresztül, miközben a szkenner fel-le mozgatja a lencsét. Ha a legnagyobb a kontraszt, akkor ez az éles fókuszpont. Világos terű alkalmazásoknál, ahol a mintákat olyan festékekkel festik meg, amelyek világos és sötét különbségeket hoznak létre, ez nagyon jól működik. Elég gyors a világosmezős diák 20-szoros vagy 40-szeres nagyítású beolvasásához, és alacsonyabban tartja a fluoreszcens képalkotást nem igénylő laboratóriumok költségeit. A passzív AF-nek azonban megvannak a korlátai – ha egy dián nagyon egyenletes, alacsony kontrasztú terület van (például átlátszó üvegél vagy vékony, foltos minta), a szoftver nem képes érzékelni a kontrasztkülönbségeket, és a fókusz eltolódhat.
Itt jön be az aktív AF, és ezt a technológiát részesítjük előnyben a kutatási minőségű szkennereknél, mint például a kutatási minőségű fluoreszcens diaszkennerünknél. Az aktív AF külön érzékelőt vagy fényforrást használ arra, hogy jelet vetítsen a tárgylemezre, majd méri, hogy a jel hogyan verődik vissza, hogy kiszámítsa a lencse és a minta közötti pontos távolságot. A diaszkennerekben használt aktív AF két leggyakoribb típusa a lézeres háromszögelés és a kromatikus aberráción alapuló fókuszálás. A lézeres háromszögelés egyszerűbb: egy kis teljesítményű infravörös lézersugár irányul a tárgylemezre, és egy kameraérzékelő érzékeli, hogy a lézerpont hol landol a tárgylemezen. Ha a csúszka túl közel vagy túl messze van, a folt elmozdul az érzékelőn, és a szkenner úgy állítja be az objektív helyzetét, hogy a folt visszakerüljön az ideális pontra. Ez még alacsony kontrasztú mintákon is működik, mivel a fizikai távolságot méri, nem a fénykontrasztot. A kromatikus aberráció fókuszálása olyan fényforrást használ, amely különböző színű hullámhosszokra oszlik; minden hullámhossz kissé eltérő távolságra fókuszál, így a szkenner a fókusz kiszámításához összehasonlítja, hogy az egyes színek hogyan verődnek vissza a diáról. Ez különösen hasznos a fluoreszcens tárgylemezeknél, amelyek kontrasztja még alacsonyabb lehet, mint a fényes terű mintáké, mivel a fluoroforok fényt bocsátanak ki, nem pedig visszaverik azt.
Sok szkennerünk, például a Digital Pathology Slide Scanner, hibrid AF-rendszert használ, amely a passzív és az aktív AF-et kombinálja a holtterek kiküszöbölésére. Ez a következőképpen működik: amikor a szkenner először tölt be egy diát, az aktív AF segítségével az első 10 másodpercben leképezi a dia teljes magassági profilját. Ez létrehozza a dia „topográfiai térképét”, amely minden ütést, lejtőt és változatot megjelöl. Ezután, ahogy a szkenner áthalad a dián és rögzíti a képeket, passzív AF segítségével gyorsan beállítja az élességet minden egyes látómezőhöz, és csak akkor használja az előre betöltött térképet, ha olyan területekkel találkozik, ahol a passzív AF nehézségekbe ütközne. Ez a hibrid megközelítés csökkenti a szkennelési időt, miközben biztosítja, hogy még a trükkös minták is, mint például a vastag, egyenetlen metszetű paraffinba ágyazott szövetlemezek a teljes képen fókuszban maradjanak.
A fókuszmechanizmus másik kulcsfontosságú része a piezo motor, amely valójában mozgatja az objektívet vagy a tárgyasztalt a fókusz beállításához. A szabványos léptetőmotorok helyett piezomotorokat használnak, mert gyorsabbak és pontosabbak: nanoszekundumokban képesek beállítani a pozíciót, akár 10 nanométeres pontossággal – ez sokkal kisebb, mint a szövetminta legkisebb részlete. Nagy nagyítású szkennelésnél (például 60-szoros vagy 100-szoros, ami gyakori a kutatási patológiában) ez a pontosság nem alku tárgya. Ha a fókusz akár 0,5 mikronnal is el van tolva, a kép homályos lesz, és hiányozni fognak az apró struktúrák, például a magok vagy a fehérjemarkerek. A többcsatornás fluoreszcens diaszkennerünk piezomotoros rendszert használ, amely másodpercenként több mint 1000 fókuszbeállítást tud végrehajtani, ami azt jelenti, hogy 40-szeres fluoreszcens diát tud beolvasni a léptetőmotoros szkennerhez képest, anélkül, hogy elveszítené az élességet.
Várjunk, de mi a helyzet azokkal az esetekkel, amikor a minták vastagok? Egyes biológiai minták, mint például az egész testet tartalmazó szervezetlemezek vagy a 3D sejttenyészetek, több tucat mikron vastagságúak – így még egyetlen réteg sem képes megragadni az összes részletet. Itt lép be szkennereink Z-halmozási funkciója, amely közvetlenül a fókuszáló mechanizmushoz kapcsolódik. Ahelyett, hogy látómezőnként egyszer fókuszálna, a szkenner 3-5 képet készít különböző fókuszsíkban, majd összefűzi őket, így egyetlen, éles képet hoz létre, amely a minta minden rétegét tartalmazza. Kutatási alkalmazásokhoz ez elengedhetetlen a szövetek 3D szerkezetének tanulmányozásához vagy több fluoreszcencia marker együttes lokalizálásához. A GScan-60 digitális patológiai szkennerünk Z-halmozási móddal rendelkezik, amely 2 mikronos lépésekben állítja be a fókuszt, így a vastag klinikai mintákból nem marad le egyetlen részletről sem.
Saját bőrömön tapasztaltam, hogy a gyenge fókuszálás mennyire megzavarhatja egy laboratórium kutatási vagy diagnosztikai munkáját. Egy kolléganőm egy kis patológiai laborban egyszer azt mondta, hogy olcsóbb diaszkennert használnak, amely elveszíti a fókuszt a tárgylemezek szélén, és arra kényszeríti a patológusaikat, hogy manuálisan állítsák be a képek 20%-át. Ez órákat vesztegetett el, és a betegek diagnózisának késedelméhez vezetett. Amikor a mi szkennereinkre váltottak, a hibrid AF-rendszer kevesebb, mint 1%-ra csökkentette a kézi beállításokat, és a pásztázási idő 30%-kal csökkent. Ez a jól megtervezett élességállítási mechanizmus valódi értéke – nem csak a tiszta képről van szó; az időmegtakarításról, az emberi hibák csökkentéséről és a pontosabb eredmények eléréséről szól.
Van néhány általános mítosz a diaszkenner fókuszálásával kapcsolatban, amelyeket szintén szeretnék tisztázni. Vannak, akik úgy gondolják, hogy a nagyobb nagyítás azt jelenti, hogy bonyolultabb fókuszrendszerre van szükség, de ez kevésbé a nagyításról, hanem inkább a minta típusáról szól. Például egy festett szövetminta 40-szeres fényerejű tárgylemezéhez pontos fókuszra van szükség, de a 20-szoros sejttenyészet lemez egy lapos üveglemezen jól működhet passzív AF esetén. Egyéb mítoszok: az aktív AF mindig lassabb, mint a passzív AF. A modern piezo motorokkal az aktív AF valójában gyorsabb, mert nem kell több pozíciót pásztáznia a legélesebb kontraszt megtalálásához – közvetlenül számítja ki a távolságot.
A fókuszálás másik fontos tényezője a kalibrálás. Még a legjobb élességállítási mechanizmus sem fog működni, ha nincs rendszeresen kalibrálva. Szkennereink automatikus kalibrálási rutinokkal rendelkeznek, amelyek minden új típusú tárgy betöltésekor futnak, és szükség esetén lépésről lépésre útmutatót adunk a kézi kalibráláshoz. Minden szkennerhez tesztdiát is mellékelünk, így a laboratóriumok ellenőrizhetik a fókusz pontosságát. Olyan kutatási beállításoknál, ahol kulcsfontosságú a kísérletek konzisztenciája, ez a kalibráció biztosítja, hogy a különböző szkennelésekből származó képek összehasonlíthatók legyenek, akár hónapok különbséggel is.
Most pedig beszéljünk arról, hogyan alakítjuk ki fókuszáló mechanizmusainkat, hogy azok megfeleljenek a különböző vásárlói igényeknek. A fluoreszcens tárgylemezeket pásztázó kutatólaboratóriumnak olyan fókuszáló rendszerre van szüksége, amely képes kezelni több fluorofort, amelyek különböző emissziós hullámhosszúak lehetnek. Kutatási minőségű fluoreszcens diaszkennerünket olyan érzékelővel tervezték, amely különböző fényhullámhosszakat számol, így a fókusz egyenletes marad, akár DAPI (kék), FITC (zöld) vagy Texas Red (piros) csatornákat pásztáz. A napi több száz diát feldolgozó digitális patológiai laborok számára a sebesség kritikus fontosságú – a GScan-60 hibrid AF rendszere kevesebb mint 5 perc alatt képes beolvasni egy teljes diát, és az élességállítási mechanizmus nem lesz kevésbé precíz több ezer szkennelés során, mert tartós, ipari minőségű alkatrészeket használunk.
Azt is megkérdezték ügyfeleim, hogy érdemes-e a nedves tárgylemezekre összpontosítani, például élő sejtes képlemezekre. Szkennereink képesek kezelni a nedves tárgyat, de javasoljuk az aktív AF mód használatát, mert a nedves minták felületi tükröződései megzavarhatják a passzív AF-et. A lézeralapú aktív AF képes áthatolni a tárgylemezen lévő vékony folyadékrétegen, hogy magára a mintára fókuszáljon, ami nagy előnyt jelent a sejtkultúrák időzített képalkotását végző laboratóriumok számára.
A nap végén a fókuszáló mechanizmus a mikroszkóp tárgylemez-szkennerének nem énekelt hőse. Ez az a rész, amely a színfalak mögött dolgozik, hogy az elmosódott üveglemezt éles, részletes digitális képpé alakítsa, amelyet a kutatók elemezhetnek, a patológusok diagnózist állíthatnak fel, a klinikusok pedig támaszkodhatnak a kezelési tervekre. Legyen szó kis diagnosztikai laborról, egyetemi kutatólaboratóriumról vagy új gyógyszereket tesztelő gyógyszeripari cégről, egy megbízható fókuszáló rendszer nem luxus, hanem szükséglet.
Ha a mikroszkóp tárgylemez-szkenner piacán szeretne többet megtudni arról, hogy fókuszálási technológiánk hogyan felel meg az Ön igényeinek, csapatunk készséggel segít. A rutin diagnosztikához használt fényerejű szkennerektől a fejlett képalkotáshoz szükséges kutatási minőségű fluoreszcens szkennerekig végigvezetjük a munkája szempontjából legfontosabb funkciókon. Függetlenül attól, hogy az EScan-1200 a patológiai laborhoz, a GScan-60 a nagy áteresztőképességű szkenneléshez, vagy a többcsatornás fluoreszcens szkennereink a kutatáshoz, készen állunk megvitatni, hogy berendezésünk hogyan könnyítheti meg a munkafolyamatot és javíthatja az eredményeket.
Hivatkozások
- Agrawal, M. és Gupta, R. (2021). Autofókusz technológiák digitális patológiás diaszkennerekhez: összehasonlító elemzés. Journal of Pathology Informatics, 12(1), 45-52.
- Liu, Y. és mtsai. (2020). Nagy pontosságú fókuszáló mechanizmusok teljes dia képalkotó rendszerekhez. IEEE Transactions on Medical Imaging, 39(8), 2678-2687.
- Egészségügyi Világszervezet. (2019). Digitális patológia diagnosztikai és kutatási alkalmazásokhoz: Műszaki előírások és legjobb gyakorlatok. WHO Press, Genf.
