Ha valaha részt vett egy állati viselkedéselemző kísérletben, tudja, hogy sokkal több történik annál, mint hogy az állatokat figyeli, amint a dolgukat végzik. Labirintusban száguldó laboratóriumi egér, akváriumban száguldó zebrahal – minden apró részlet kidobhatja az adatait, ha nem vigyáz. Ezért a változók szabályozása a szilárd állati viselkedéskutatás gerince. Évek óta részt veszek az állatok viselkedését elemző játékban, laboratóriumokkal és kutatókkal dolgozom mindenhol, és legyünk őszinték: ez nem csak a menő eszközökről szól – hanem arról, hogy minden változót le kell szögezni, még azokat is, amelyeket nem gondolsz.
Először is beszéljünk azokról a nagyokról, amelyeket nem szabad figyelmen kívül hagyni: a biológiai változókról. Ez nem csak „hány éves az egér” (bár ez hatalmas). Feszültség, szex, egészség, még a cirkadián ritmus is – mindez megváltoztatja a viselkedést. Egyszer pánikba esett hozzám egy kutató, mert a tesztcsoportjuk labirintusbeli teljesítménye mindenhol ott volt. Kiderült, hogy két egértörzset kevertek össze: a C57BL/6-ot, amelyek szuperfényesek, és a BALB/c-t, amelyek sokkal idegesebbek. Nem csoda, hogy az adatok összevissza voltak. Tehát első lépés: szabványosítsa a tantárgyait, amennyire csak lehetséges. Ha nem tudja pontosan ugyanazt a törzset, nemet és életkort használni minden csoporthoz, legalább egyenletesen ossza el ezeket a változókat a kontroll- és tesztcsoportok között.
A cirkadián ritmus egy másik olyan, amely megbotránkoztatja az embereket. Az állatok nem úgy viselkednek reggel 9-kor, mint este 9-kor. Az egerek éjszakaiak, igaz? Ha teszteli az egeret a fényciklusa végén (amikor fáradt), sokkal lassabban mozog, mint ha sötét fázisban tesztelné. Ügyfeleink a vizsgálati ütemtervüket igazították alanyaik aktív idejéhez, és az adatok konzisztenciája átugrott a tetőn. Ez egy kis finomítás, de hatalmas különbséget jelent.
Ezután a környezeti változók. Itt maga a laborbeállítás válhat változóvá, ha megengedi. Fény, hang, hőmérséklet, páratartalom – mindezek befolyásolják az állatok viselkedését. Láttam, hogy egy labor vízlabirintus eredményei elferdülnek, mert az AC közvetlenül a tartály egyik oldalán fújt, és ott kissé hidegebbé tette a vizet. Az egerek esetében még egy új kutató parfümjének illata is stresszt okozhat, és megváltoztathatja viselkedésüket.
Ezért jelent óriási különbséget az olyan dedikált rendszerek használata, mint a Radial Arm Maze. Várj, ha meg akarod nézni, itt van:Radiális kar labirintus. Ez a rendszer nem csak egy labirintus – ez egy ellenőrzött környezet állandó világítással, hangszintekkel, sőt minden mozdulatot rögzítő nyomkövetővel, így nem kell tartania az emberi hibáktól a karbelépések számlálása során. Maga a labirintus úgy van kialakítva, hogy minimalizálja a külső zavaró tényezőket, így biztos lehet benne, hogy a viselkedésben tapasztalt változások a tényleges tesztváltozóból származnak, nem a helyiségből.
Aztán ott vannak a teszt futtatásának módjához kapcsolódó változók. Kezelők, vizsgálati protokollok, még az állatok tesztelésének sorrendje is – ezek mind elfogultsághoz vezethetnek. Például, ha az egyik kutató kezeli a kontrollcsoportot, egy másik pedig a tesztcsoportot, az állatok minden egyes személyre eltérően reagálhatnak, és eltorzítják az eredményeket. Ezt hívják kísérletező elfogultságnak, és sokkal gyakoribb, mint azt az emberek gondolják.
Javasoljuk, hogy minden tesztelőt ugyanúgy képezzenek ki, ugyanazokat a kezelési technikákat használva, hogy az állatok ne vegyenek észre finom különbségeket abban, ahogyan megragadják vagy beszélik őket. Ezenkívül a vizsgálatok sorrendjének randomizálása – ne először az összes kontrollállatot végezze el, csak azután az összes vizsgálati állatot. Keverje össze, így a nap folyamán a laborban bekövetkezett apró változások (például a világítás elsötétülése vagy az AC bekapcsolása) mindkét csoportra egyformán hatással vannak.
Most lássuk specifikusan a különböző típusú viselkedési teszteket, mert a változó vezérlés kissé eltérően néz ki attól függően, hogy mit tanul. Vegyük például a viszkető viselkedést. Ha azt vizsgálja, hogy egy gyógyszer hogyan befolyásolja a viszketési reakciót, akkor a gyógyszeren kívül mindent ellenőriznie kell, ami megkarcolhatja az állatot. Itt jön be az állati viszketés viselkedését elemző rendszerünk – nézze meg itt:Az állati viszketés viselkedését elemző rendszer. Ez a rendszer videokövetést használ, hogy pontosan megszámolja, hányszor vakarja meg az állat, és úgy van beállítva, hogy kiküszöbölje a zavaró tényezőket, így nem tévesztheti össze a véletlenszerű ápolást a viszketéssel összefüggő vakarással. Olyan dolgokat is vezérel, mint az állat helyzete (az ülő és az álló helyzet megváltoztathatja, hogy mennyit karcolnak) és még a napszakot is, így a viszketési adatok sziklaszilárdak.
A járáselemzés egy másik olyan terület, ahol kritikus a változó szabályozás. Ha azt tanulmányozza, hogy egy sérülés vagy gyógyszer hogyan befolyásolja az állat járását, a teszt beállításában lévő apró eltérések azt eredményezhetik, hogy a járás megváltozik, ha csak a beállításról van szó. Nagy felbontású egycsatornás (több) járáselemző rendszerünk erre készült – itt a link:Nagy felbontású egycsatornás (több) járáselemző rendszer. Nyomásérzékelőket és nagy sebességű kamerákat használ, amelyeket minden egyes alkalommal kalibrálnak, így minden állat járása azonos körülmények között kerül mérésre. Nincs többé egyenetlen padlófelület vagy inkonzisztens kameraállás, amely összezavarja az adatokat. Idegtudományi laboratóriumaink ezt használták az egerek Parkinson-kórral kapcsolatos járásváltozásainak nyomon követésére, és azt mondták nekünk, hogy az adatok sokkal reprodukálhatóbbak, mint a régi beállításukkal.
Mi a helyzet a zebrahalral? Nagyon gyakoriak a fejlődési és idegtudományi kutatásokban, és a vesztibuláris okuláris reflexük (VOR) tesztelése ennek nagy részét képezi. A VOR az, ami stabilan tartja a látásukat úszás közben, így ha ez ki van kapcsolva, akkor a belső fülről vagy az agyműködésről tájékoztat. A változók szabályozása itt azt jelenti, hogy a tartály tökéletesen mozdulatlan, a víz hőmérséklete állandó, és a vizuális ingerek minden alkalommal azonosak. Ez az oka annak, hogy a Zebrafish Vestibularis Ocularis Reflex Testing System rendszerünket minderre tervezték – link itt:Zebrafish vestibularis szemreflex tesztelő rendszer. Szabályozza a víz áramlását, a fényszintet és az inger frekvenciáját, így biztos lehet benne, hogy a VOR változásai a tesztalanytól származnak, nem a környezettől. Sok zebrahal laborral dolgozunk együtt, és esküsznek erre a rendszerre, hogy csökkentsék az adatok változékonyságát.
És ne feledkezzünk meg az auditív tesztelésről sem, például az egér hallási agytörzsi válasz (ABR) tesztekről. Ha a halláskárosodást vagy azt, hogy egy gyógyszer hogyan befolyásolja a hallást, meg kell győződnie arról, hogy a hangingerek minden állatnál pontosan ugyanazok, és az eredményeket nem zavarja meg a háttérzaj. Az Egér Auditív Agytörzsi Válasz Tesztelő Rendszerünk erre készült – nézze meg itt:Egér auditív agytörzsi válaszvizsgáló rendszer. Hangszigetelt kamrákat, kalibrált hangszórókat és következetes elektródaelhelyezést használ, így az ABR-adatok pontosak és megbízhatóak. Egy kutató, akivel együtt dolgoztam, korábban alapvető ABR-beállítást használt, és a küszöbadatok között 10 decibel különbség volt az állatok között, aminek ugyanannak kellett volna lennie. Miután átváltottunk a rendszerünkre, ez a különbség 2 decibel alá csökkent – ez óriási a hallásváltozások értelmezéséhez.
Várjon, de még az összes divatos eszköz mellett is van egy változó, amelyet könnyű kihagyni: az adatelemzést. A kódolás és a pontozás viselkedése is torzítást eredményezhet. Ha manuálisan értékeli az állatok viselkedését bemutató videót, nagyobb valószínűséggel számol egy viselkedést, ha az a tesztcsoportban szerepel, igaz? Ezért jobb az automatizált nyomon követés (mint az általunk kínált rendszerek), de ha manuálisan kell pontoznia, használja a vakpontozást. Ez azt jelenti, hogy a videót pontozó személy nem tudja, melyik csoportba tartozik az állat – csak nézi a videót, és számolja a viselkedéseket anélkül, hogy tudná, hogy kontroll vagy teszt. Nem tudom megmondani, hogy hányszor javították ki a rosszindulatú adatokat. Rendszereink felállításakor minden ügyfelünket a vakpontozásra oktatjuk, mert ez egy egyszerű lépés, amely óriási különbséget jelent.
Egy másik dolog: a minta mérete. Sok kutató kihagyja ezt, de ha a minta túl kicsi, a véletlenszerű variáció miatt az adatok valódi hatásnak tűnhetnek, ha nem. Ezt hívják I. típusú hibának. Segítünk ügyfeleinknek kitalálni a megfelelő mintaméretet teszttípusuk és változóik alapján, így nem vesztegetik az időt (és pénzt) olyan kísérletekre, amelyek nem rendelkeznek elegendő adattal ahhoz, hogy értelmesek legyenek. Például, ha egy Radial Arm Maze tesztet futtat egereken, akkor előfordulhat, hogy csoportonként 15-20 állatra lesz szüksége ahhoz, hogy konzisztens eredményeket érjen el – túl kevés, és egy rendkívül ideges egér kidobhatja az egész csoportot.
Hadd osszam meg egy gyors történetet, amely hazavezette. Néhány hónappal ezelőtt egy új ügyfél érkezett hozzánk, csalódottan, mert korábbi labirintuskísérletük ellentmondó eredményeket hozott. Két különböző egértörzset használtak, véletlenszerű napszakokban tesztelték, és maguk is pontozták a labirintusos videókat (tudva, hogy melyik a teszt vagy a kontroll). Dolgoztunk velük az összes változó javításán: csak egy törzset használtunk, minden nap ugyanabban az időben teszteltük (a sötét fázisban, amikor az egerek aktívak), és egy harmadik fél vakpontozta a videókat. Amikor újra lefuttatták a tesztet a Radial Arm Maze-nkkel, az eredmények kristálytiszták voltak – nincs több ellentmondó adat. Végül közzétették ezeket az eredményeket, és elmondták, hogy az első kísérlet kudarcának egyetlen oka az volt, hogy nem irányították a változókat. Ez a baj az állatok viselkedésével: ez nem rakétatudomány, de könnyű átengedni a kis változókat a réseken.
Összefoglalva tehát: a változók ellenőrzése az állatok viselkedésének elemzésében a szándékosságról szól. Kezdje az alanyok szabványosításával (terheltség, nem, életkor, egészségi állapot), határozza meg a környezetet (világítás, hang, hőmérséklet), szabályozza a teszt futtatását (kezelő, sorrend, ingerek), használjon precíz mérésre tervezett eszközöket, és győződjön meg arról, hogy adatelemzése elfogulatlan. Hagyja ki a parancsikonokat – még a legkisebbeket is, mint például a rossz időben történő tesztelést vagy a törzsek keverését –, és sokkal megbízhatóbb adatokat kaphat.
Ha szigorítani szeretné a változó szabályozást, legyen szó labirintus-tesztekről, viszketési tesztekről, járáselemzésről, zebradániás VOR-tesztekről vagy egér ABR-ekről, akkor a rendszereink segítenek. Bármilyen méretű laboratóriummal dolgozunk, a kis akadémiai csapatoktól a nagy gyógyszergyártó cégekig, és minden lépésen végigvezetjük Önt – az eszközök beállításától egészen a lehető legellenőrzöttebb kísérletig. Nincs zsargon, nincs karika, egyszerűen beszéljen az adatok jobbá tételéről. Forduljon hozzánk, ha készen áll az állatok viselkedésének elemzésére, és gondoskodjunk arról, hogy a következő kísérlet a szükséges egyértelmű, megbízható eredményeket adja.
Referenciák:
- Garland Jr, T. és Adolph, JS (1994). Gerinces genotípusok fiziológiai differenciálódása. American Zoologist, 34(1), 151-165.
- Crabbe, JC, Wahlsten, D. és Dudek, BC (1999). Az egér viselkedésének genetikája: kölcsönhatások laboratóriumi környezettel. Science, 284(5420), 1670-1672.
- Blanchard, DC és Blanchard, RJ (1988). Az érzelmek biológiájának etohexperimentális megközelítései. Annual Review of Psychology, 39(1), 43-68.
- Metten, P., Crabbe, JC és Rhodes, JS (2005). Mi a normális? Viselkedési változatosság a laboratóriumi egérben. Current Opinion in Neurobiology, 15(2), 145-150.
- Prescott, MJ és Prescott, A. (2011). Állatmodellek alkalmazása az érzékszervi kutatásokban. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 366(1581), 3002-3013.
