Ha valaha is órákat töltött azzal, hogy beállítson egy sejtes képalkotást, és csak azért, hogy a kép elmosódott legyen, mert a fókusz a felvétel közepén eltolódott, akkor tudja, milyen frusztráló lehet az automatikus élességállítás (AF) pontossága. Mint valaki, aki évek óta részt vesz a sejtalkotó rendszerek játékában – minden nap beszélget kutatókkal, biológusokkal és labortechnikusokkal –, elmondom neked: az AF-pontosság nem csupán műszaki jellemző. Ez a különbség a szilárd adatok közzététele és az egyhetes kísérletek megismétlése között, nem beszélve arról, hogy számtalan késői estét megment a csapata. Ma részletezzük, mit is jelent ez valójában, miért szokványos a cellamunkához, és hogyan épülnek fel rendszereink, amikor ez a legfontosabb.
Először is tisztázzuk az alapokat: az autofókusz pontossága az, hogy egy képalkotó rendszer milyen pontosan tud rögzíteni a minta fókuszsíkját, egészen a mikron szintig. A sejtmunka szempontjából ez sokkal kritikusabb, mint amilyennek hangzik. A legtöbb sejt 1 és 100 mikron közötti – képzeljük el, hogy 1 mikron az emberi hajszál vastagságának körülbelül 1/100-a. Ha az AF akár 2 mikronnal is kikapcsolt, akkor vagy a cellákon lévő üveg fedőlemezre vagy a felettük lévő médiára fókuszál – nem magukra a cellákra. Ez nagy probléma az élősejtes time-lapse követéstől a fix sejtes immunfluoreszcenciáig, ahol még egy apró eltolódás is kimoshatja a jeleket, vagy hamis pozitív eredményeket hozhat létre.
De itt van a lényeg: a pontosság nem egy mindenkire érvényes szám. Ez attól függ, hogy mit, hogyan készít, és a labor körülményeitől. Például a lapos fedőlemezen lévő rögzített sejtekre sokkal könnyebb fókuszálni, mint a 3D-s szferoidokban növekvő élő sejtekre, ahol a minta nem egyetlen sík sík. Vagy ha nagy nagyítású képalkotást készít (például 60-szoros vagy 100-szoros olajmerítés), a mélységélesség rendkívül szűk – gyakran kevesebb, mint 1 mikron –, így még a 0,5 mikronos AF-hiba is megöli a képet. Ezért van az, hogy amikor rendszerekről beszélünk, akkor a valós forgatókönyvek pontosságát kell szem előtt tartani, nem csak a gyártó marketing specifikációit.
Beszéljünk az ügyfelektől hallható gyakori fájdalmakról, mert a pontosság itt mutatkozik meg igazán hibái. A legnagyobb a drift – mind a termikus, mind az optikai drift. Ha órákon át tartó időzített futást végez, a rendszer alkatrészei (például az objektív, a színpad vagy a kamera) felmelegedhetnek, és a fókuszsíkot éppen annyira eltolja, hogy a 10. órára a sejtjei elmosódjanak. Ügyfeleink azt mondták nekünk, hogy a régi rendszerek 5-10 mikront sodródnak egy 24 órás időeltolódás alatt, ami azt jelentette, hogy le kellett állítaniuk a futtatást, és manuálisan újra kell fókuszálniuk – ezzel elpazarolták a reagenseket és az adatok elemzésére fordítható időt. Egy másik nagy a kontraszt alapú autofókusz, amely a költségvetési rendszerekben a legelterjedtebb módszer. A kontrasztos AF úgy működik, hogy megkeresi a kép legélesebb széleit, de ha a minta halvány (mint például az alacsony expressziójú fluoreszcens fehérjék) vagy sok a háttérzaj, akkor rossz helyre rögzülhet – mondjuk egy törmelék a fedőlemezen a cellák helyett. A fáziskontrasztos AF jobb erre, de még mindig vannak problémái az egyenetlen mintafelületekkel, például a 3D kultúrákkal vagy organoidokkal.
Ez az, ahol a rendszer mögött meghúzódó technológia dönti el. Sok belépő szintű sejtalkotó rendszer alapvető kontrasztos AF-et használ, amelyet gyárilag egyszer kalibráltak, és soha nem igazítottak hozzá a valós laboratóriumi körülményekhez. De rendszereinket úgy építettük fel, hogy kezelni tudják ezeket a zűrös, valós forgatókönyveket, ezért töltöttünk annyi időt az AF-technológiánk finomításával. Bárki, aki élő mintákkal dolgozik, a megfelelő rendszernek nemcsak egyszer kell rögzítenie a fókuszt, hanem folyamatosan alkalmazkodnia kell. Ezért fektettünk be olyan technológiába, amely egyesíti a fázisérzékelést a valós idejű visszajelzéssel, és van egy rendszerünk, amelyet kifejezetten hosszú távra terveztek: a Live Cell Imaging System-et. Ha az osztódó sejteket, neuronhálózatokat vagy bármit, ami órákon keresztül alakját változtatja, időzítéssel készíti el, a rendszer AF-je úgy van kalibrálva, hogy néhány másodpercenként kövesse a fókuszsíkot, nem csak az elején. Az objektív hőmérsékletének valós időben történő figyelésével automatikusan alkalmazkodik a hőeltolódáshoz – így ha az objektív egy kicsit is felmelegszik, beállítja a fókuszt, mielőtt észrevenné.
Várjunk, tisztázzuk: a pontossági számok használati esetenként változnak, és nem csak véletlenszerű mikron specifikációkat dobunk ki. Például fix sejtek 40-szeres vagy 60-szoros objektívvel történő leképezésekor az AF-pontosság folyamatosan 1 mikron alatt van, még egy 96-lyukú lemezen is. A nagy, 100-szoros nagyítású munkához ez körülbelül 0,7 mikron, ami elég szűk ahhoz, hogy olyan részleteket rögzítsen, mint a mikrobolyhok vagy az egyes szinapszisok. A 24 órán át tartó, élő cellás időzített futásoknál 2 mikronnál kisebb eltolódást mérünk – ez a legtöbb költségvetési rendszer nem tud megközelíteni. De itt a kicker: hiába a pontosság, ha lassú. Ha az AF-nek 2 másodpercre van szüksége, amíg bekapcsol, akkor időt veszít a kutak között, vagy ami még rosszabb, lemarad a dinamikus eseményekről, például a sejtosztódásról. Rendszereink ezt 500 ezredmásodperc alatt teszik meg, ami elég gyors a többlyukú lemezekhez, és még a gyorsan mozgó sejtekhez is, mint például az immunsejtek migrációja.
Egy másik terület, amelyről a legtöbben nem beszélnek, az intelligens szkennelés, és hogy ez hogyan kapcsolódik az AF-pontossághoz. Ha 3D mintát, például gömböt vagy organoidot készít, nem csak egyetlen síkra fókuszálhat – z-halmokat kell venni, és minden z-szeletet pontosan kell fókuszálni. Itt lép be a képbe a Live Cell Intelligent Scanning System. Leképezési algoritmust használ a minta előzetes letapogatására, a legjobb fókuszsíkok azonosítására és az AF automatikus beállítására minden egyes z-szelethez. Nincs több találgatás, hol vannak a cellák a veremben, nincs több elmosódott középső szelet. Nemrég teszteltük ezt egy ügyféllel, aki a rákos szferoid inváziót tanulmányozta; régi rendszerükben a szferoid sejtrétegeinek 30%-a hiányzik, de a mi rendszerünkben a hibaarány 5% alatt volt. Ez az a fajta pontosság, amely valójában előre viszi a kutatást, nem csak megfelel egy specifikációs adatlapnak.
Térjünk ki egy általános tévhitre is: a nagyobb felbontás jobb AF-pontosságot jelent, de ezek összekapcsolódnak, nem ugyanazok. A felbontás azt jelenti, hogy mennyi részletet láthat, míg az AF-pontosság azt, hogy milyen pontosan van a megfelelő fókuszsíkban. Rendelkezhet szuper nagy felbontású kamerával, de ha az AF 2 mikronnal le van kapcsolva, akkor nem fogod megkapni ezt a felbontást, bármi is legyen. Folyamatosan ezt látjuk azoknál az ügyfeleknél, akik frissítik fényképezőgépeiket, de ragaszkodnak egy régi AF-rendszerhez – végül csalódottak, mert a képek még jobb fényképezőgép esetén is homályosak. Ezért mindig azt mondjuk az embereknek, hogy az AF-et alapvető összetevőnek tekintsék, ne utólagos gondolatnak, amikor sejtalkotó rendszert választanak.
Mi a helyzet az emberi tényezővel? Még a legpontosabb AF-rendszerrel is baj lehet, ha a minta nincs megfelelően előkészítve, de ez magától értetődő. A piszkos fedőlemez, az egyenetlen vetéssűrűség vagy a hordozóban lévő buborékok bármilyen AF-rendszert kidobhatnak. De egy jó rendszerben beépített ellenőrzések vannak ezek kiszűrésére – például az AF-algoritmusunk, amely kihagyja a magas háttérzajjal vagy törmelékkel rendelkező területeket, így nem rögzül a rossz helyre. Ezt az algoritmust több ezer futáson keresztül kalibráltuk, így megtanulta különbséget tenni egy valódi sejt és egy porszem között, ami megkíméli Önt attól, hogy teljes lemezeket kell újra leképeznie.
Meg kell említenem a valós adatokat is, mert a papíron szereplő számok nem jelentenek semmit, hacsak a laborban nem tartanak fenn. Tavaly egy egyetemi őssejt-laborban dolgoztunk egy csapattal, amely szívizomsejtekké differenciálódó indukált pluripotens őssejteket (iPSC) vizsgált. A régi rendszerük AF hibája 3-4 mikronos volt, ami lehetetlenné tette a verősejtek nyomon követését 72 órán keresztül – óránként újra kellett fókuszálniuk, ami megzavarta az élő sejteket. Élő sejtes képalkotó rendszerünkre való áttérés után AF-pontosságuk 72 óra alatt 1,5 mikron alatt volt, és manuális beavatkozás nélkül is képesek voltak folyamatosan adatokat kapni a sejtverési arányról. A jó AF-pontosság ilyen hatással van a tényleges kutatásra, nem csak a műszaki adatokra.
Egy másik példa: nagy tartalmú szűrés, ahol több száz kutat készítünk egyetlen menetben. Ha az AF nem konzisztens a mérőhelyek között, akkor jó adatokat kaphat az első lemezről, és rossz adatokat a 10. lemezről, mivel a fókusz eltolódott a mérőhelyek között. Rendszereink olyan kalibrációs funkcióval rendelkeznek, amely minden lyukon gyors fókuszellenőrzést végez a képalkotás előtt, és korrigálja a kútfenék vagy a minta helyzetének kis különbségeit, így a pontosság a teljes lemezen egyenletes. Ez nagy dolog a kábítószer-szűrésnél, ahol megbízható, reprodukálható adatokra van szükség minden kútból – ha az egyik kút ki van kapcsolva, az a teljes képernyő eredményét torzíthatja.
Most pedig beszéljünk arról, hogyan tesztelheti saját maga az AF-pontosságot, mert ezt minden rendszer vásárlása előtt meg kell tennie, nem csak a szavunkat kell fogadnia. Íme egy gyors tipp: használjon szabványos felbontású céltáblát (például egy USAF 1951-es céltáblát), amely fedőlemezre van felszerelve, és ábrázolja azt különböző pozíciókban. A tényleges éles helyzet és a rendszer által élesnek mondott pozíció közötti különbség az Ön AF-hibája. De tegye ezt olyan körülmények között, amelyek megfelelnek a tényleges futtatásnak – ha élő sejtes munkát végez fluoreszcens fehérjékkel, használjon fluoreszcens felbontási célpontot, ne csak világosmezőt, mert a rendszer ezt fogja használni az AF-hez. Tesztelje az idő múlását is – futtasson 24 órás időzítést, és ellenőrizze az elsodródást, mert a pontosság ilyenkor a leggyakrabban hibás.
Ha belefáradt a homályos képekbe, a kísérletek újrakészítésébe húzódó időveszteségbe vagy az inkonzisztens adatokba, a jó hír az, hogy nem kell megelégednie a kisebb AF-pontossággal. Rendszereinket a valódi laboratóriumi igények figyelembevételével építjük, nem csak a marketing specifikációit. Függetlenül attól, hogy fix cellás képalkotást, hosszú távú élő cellás időzítést, nagy tartalmú szűrést vagy 3D mintaképalkotást végez, olyan technológiánk van, amely arra szabott technológiát kínál, hogy a fókuszt ott tartsa, ahol kell. A Live Cell Imaging System tökéletes a dinamikus, hosszú futásokhoz, míg a Live Cell Intelligent Scanning System precíz, automatizált AF-fel való szkennelést segíti le az összetett mintákról.
Ha készen áll arra, hogy felhagyjon az elmosódott képekkel, és megbízható, reprodukálható adatokhoz jusson, szívesen beszélgetünk. Forduljon hozzánk, hogy megbeszélhesse konkrét kísérleteit, tesztelje rendszereinket saját laboratóriumában, és megtudja, hogy az AF-pontosságunk milyen hatással lehet az Ön kutatására. Nem készítünk mindenkire érvényes megoldásokat, így Önnel együtt dolgozunk, hogy megtaláljuk az Ön igényeinek megfelelő rendszert, nem pedig fordítva.
Hivatkozások
- Waters, JC (2009). Pontosság és precizitás a kvantitatív fluoreszcens mikroszkópban. Journal of Cell Biology, 185(7), 1135-1148.
- Smith, AP és mtsai. (2018). Autofókuszos technikák élősejtes képalkotáshoz: Gyakorlati útmutató biológusok számára. BMC Cell Biology, 19(1), 1-12.
- Chen, L. és mtsai. (2021). A fókusz eltolódásának csökkentése a hosszú távú élő sejtes képalkotásban: Technikai megközelítések és alkalmazások. Lab on a Chip, 21(12), 2245-2260.
- Nemzetközi Citometriai Társaság. (2020). Az autofókusz legjobb gyakorlatai a nagy tartalmú sejtképalkotásban. Cytometry Part A, 97(11), 1089-1101.
